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                      重組腺相關病毒載體

                      目    錄
                      • 產品介紹
                      • 常見問題
                      • 經典案例
                      • 結果展示

                      腺相關病毒(adeno-associated virus, AAV)是微小病毒科(Parvoviridae)家族的成員之一,是一類無法自主復制、無被膜的二十面體微小病毒,其直徑約20-26nm,含有4.7kb左右的線狀單鏈DNA作為基因組。研究中采用的重組腺相關病毒載體(Recombination adeno-associated virus, rAAV)是在非致病的野生型AAV基礎上改造而成的基因載體,由于其種類多樣、免疫原性極低、安全性高、宿主細胞范圍廣(對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力)、擴散能力強、體內表達基因時間長等,rAAV被視為最有前途的基因研究和基因治療載體之一。


                      AAV基因組及其編碼的蛋白(圖1) 
                      1)rAAV包裝與純化
                       AAV病毒包裝過程中,包裝質粒負責編碼目的基因以及兩個末端反向重復序列(ITR,對于病毒的復制和包裝具有決定性作用),輔助質粒包含AAV包裝所需的 (編碼病毒衣殼蛋白)和 (參與病毒的復制)基因,以及腺病毒Helper質粒。三種質粒共同轉染293T細胞后,AAV病毒開始復制和包裝。聯川生物合作公司和元上海腺相關病毒的生產和質控采取了國際學術界公認的標準流程,采用三質粒系統在293T細胞中進行包裝,共轉染后通過對細胞裂解物進行密度梯度離心純化和收集病毒。


                      rAAV包裝及純化
                      rAAV滴度檢測
                      檢測方法:定量PCR檢測病毒基因組中外源DNA拷貝數
                      實驗原理:腺相關病毒的基因組為單鏈DNA,外源DNA拷貝數代表病毒基因組拷貝數

                      2) rAAV侵染細胞過程
                      純化后的AAV病毒載體可以用于侵染細胞,侵染細胞時,AAV與細胞表面特異性受體結合,激活胞內信號通路,進而觸發受體介導的AAV通過受體介導的內吞作用進入細胞,在核內體(Endosome)、高爾基體等細胞器的協助下進入細胞核,隨后病毒裂解,其單鏈DNA需復制成為雙鏈DNA后表達目的基因。


                      腺相關病毒作用機制

                      3) AAV特點
                      1、 安全性高、免疫原性低:AAV是一種復制缺陷型DNA病毒,無自主復制能力,野生型AAV依賴rep基因進行低頻定點整合,rAAV不整合。目前尚無由AAV引起的人類及哺乳動物疾病報道,也是FDA批準上市的基因治療藥物中最安全的病毒載體之一。
                      2、 宿主細胞范圍廣:AAV具有廣泛的宿主范圍,對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力。
                      3、 擴散能力強:AAV直徑約20-26nm,體積小,滴度高,具有良好的擴散能力,其中AAV-PHP.eB和AAV9具有跨血腦屏障的能力,在神經科學領域應用廣泛。
                      4、 體內表達基因時間長:AAV具有保持長期基因轉錄表達能力,體內表達一般3周可以達到高峰,隨后持續表達,作用時間>5個月。
                      5、 載體容量?。?由于AAV的體積小,其是實驗室常見病毒載體系統中裝載量最小的。AAV的兩個ITR之間所能容納的最大序列長度是4.7 kb。
                      6、 種類多樣:AAV血清型眾多,此外,根據不同的實驗設計,我們還在不斷的突變,篩選新的血清型(AAV1-13,AAV2/1, 2/2, 2/5, 2/6, 2/8, 2/9, DJ; retro, PHP.eB…)。

                      目前已注冊的AAV種類總數已超過196種,靈長類動物體內有13種不同血清型的AAV(即AAV1-AAV13),其中AAV2、AAV3、AAV9源自人類本身,值得注意的是,AAV2是最早被克隆的病毒,也是迄今研究最為徹底、應用最為廣泛的病毒載體。隨著研究的不斷深入,研究人員發現不同血清型的AAV之間可以雜交,而雜交后的AAV會兼有雜合雙方的特點,因此,AAV亞型順勢誕生。
                      現在研究中常用的rAAV就是利用AAV2型基因組與不同的衣殼蛋白結合產生的混合體病毒載體,一般標記為rAAV2/N (N為不同的衣殼血清型)。重組的病毒具有AAV2型的穩定表達和基因整合能力,同時獲得了不同血清型的組織感染嗜親性(不同血清型衣殼表面的特定結構位點決定了各自受體的特異性),表現出一定的器官靶向特異性(表1)。

                      表1 不同血清型AAV的組織嗜親性

                      小建議:如您不確定選擇哪種血清型,可嘗試使用和元上海Pandora’s Virus (AAV試用裝)進行預實驗,通過比較不同血清型對目標組織的感染效果,摸索最佳實驗條件(注射方法、注射位點、病毒用量等),以便得到更理想的實驗結果。

                      基于上述特點,AAV被視為是一種高效和安全的體外及體內基因轉導工具。尤其在整體水平研究中,與其他常用病毒工具載體相比,AAV具有感染過程溫和長效的表達能力,而成為基因操作的利器(表2)。

                      表2 不同病毒的生物學特性比較

                      4) AAV應用案例
                      1、 廣譜及特異性

                      表3 常用啟動子列表

                      1.1 廣譜啟動子
                      客戶發表文章:EMBO Rep. (IF= 8.749). Li XG,et.al. (2019). Tau accumulation triggers STAT1-dependent memory deficits by suppressing NMDA receptor expression. [腺相關病毒, AD, 過表達,干擾]


                      注射部位:小鼠海馬CA3區
                      載體:AAV-CMV-Y701F-STAT1-RFP&AAV-CMV-hTau-EGFP
                      病毒滴度:5 × 1012 VG/mL&1.13 × 1013 VG/mL
                      觀察時間:1個月

                       

                      1.2 特異性啟動子
                      客戶發表文章:Nature Neuroscience. (IF=19.912). Li YD,et.al. (2017). A distinct entorhinal cortex to hippo-campal CA1 direct circuit for olfactory associative learning. [腺相關病毒, 學習與記憶, 光遺傳]

                      注射部位:小鼠LEC區
                      載體:AAV-CaMKIIα-eNpHR3.0-EYFP
                      病毒滴度:2× 1012 VG/mL
                      觀察時間:1個月

                      AAV病毒載體配合特異性啟動子的選擇,可實現部分細胞類型的特異性表達; 此外,借助Cre鼠(Cre-LoxP系統),利用AAV攜帶的DIO結構可高精度靶向特異類型神經元。

                      1.3 依賴Cre鼠特異性表達
                      客戶發表文章:PNAS. (IF=9.674). Du H,et.al. (2016). Dopaminergic inputs in the dentate gyrus direct the choice of memory encoding. [腺相關病毒, 學習與記憶, 光遺傳]


                      注射部位:TH-Cre小鼠VTA
                      載體:AAV-DIO-ChR2-mCherry
                      病毒滴度:1× 1013 VG/mL
                      注射體積:500nl
                      觀察時間:1個月

                      2、在神經科學領域中的應用
                      2.1 外側韁核&光遺傳學
                      客戶發表文章:Nature. (IF=41.577). Yang Y,et.al. (2018). Ketamine blocks bursting in the lateral habenula to rapidly relieve depression. [腺相關病毒, 抑郁癥, 光遺傳]


                      注射部位:小鼠LHb
                      載體:AAV2/9-hSyn-oChIEF-tdTomato
                      血清型:AAV2/9
                      病毒滴度:6.29× 1012 VG/mL
                      注射體積:100nl
                      觀察時間:1個月

                       

                      2.2 臂旁核&化學遺傳學
                      客戶發表文章:Science. (IF=41.058). Mu D,et.al. (2017). A central neural circuit for itch sensation. [腺相關病毒, 癢, 光遺傳,化學遺傳]


                      注射部位:小鼠PBN
                      載體:AAV-hSyn-HA-hM4Di-IRES-mCitrine
                      血清型:AAV2/9
                      病毒滴度:1.0× 1013 VG/mL
                      注射體積:150nl
                      觀察時間:3周

                      2.3 丘腦&鈣離子成像
                      客戶發表文章:客戶發表文章:Science. (IF=41.058). Ren S,et.al. (2018). The paraventricular thalamus is a critical thalamic area for wakefulness. [腺相關病毒, 覺醒]


                      注射部位:小鼠PVT
                      載體:AAV-CaMKIIα-GCaMP6f
                      注射體積:100nl
                      觀察時間:4周

                      2.4 丘腦室旁核&殺死神經元
                      客戶發表文章:Science. (IF=41.058). Ren S,et.al. (2018). The paraventricular thalamus is a critical thalamic area for wakefulness. [腺相關病毒, 覺醒]


                      注射部位:小鼠PVT
                      載體:AAV-CaMKIIα-Cre-GFP &AAV-DIO-caspase-3
                      注射體積:兩支病毒1:1混合注射100nl
                      觀察時間:4周

                      2.5 海馬、皮層&逆向非跨突觸(rAAV2-retro)
                      客戶發表文章:Biological Psychiatry. (IF=11.984). Bing Xing Pan,et.al. (2018). Chronic stress causes projection-specific adaptation of amygdala neurons via SK channel downregulation. [腺相關病毒, 焦慮癥, 光遺傳]


                      注射部位:小鼠dmPFC、VHPC
                      載體:AAV2/1-retro-Syn-eYFP-Cre、AAV2/8-CaMKIIα-DO-SK2&AAV2/8-CaMKIIα-DIO-SK2-mCherry
                      注射體積:300nl
                      觀察時間:4周

                      2.6 初級運動皮層&順向跨突觸(rAAV2/1)
                      Nature Neuroscience. (IF=19.912). Yao J,et.al. (2018). A corticopontine circuit for initiation of urination. [腺相關病毒, 神經環路]


                      注射部位:小鼠皮層M1、PMC
                      載體:rAAV2/1-hSyn-Cre&rAAV2/9-DIO-hChR2(H134R)-mCherry、rAAV2/9-DIO-GCaMP6s
                      病毒滴度:rAAV2/1: 5 × 1012 VG/mL;rAAV2/9-DIO-hChR2:1.2 × 1013 VG/mL;rAAV2/9-DIO-GCaMP6s:0.5 × 1012 VG/mL
                      注射體積:多點注射,每位點30-40nl
                      觀察時間:4周

                      2.7 邊緣前皮質&跨突觸示蹤(WGA-Cre)
                      客戶發表文章:Science Advances. (IF=11.511). Ping Zheng,et.al. (2019). Crucial role of feedback signals from prelimbic cortex to basolateral amygdala in the retrieval of morphine withdrawal memory. [腺相關病毒, 成癮, AAV1, AAV-WGA-Cre]


                      注射部位:小鼠PrL
                      載體:AAV-hSyn-mCherry-IRES-WGA-Cre
                      病毒滴度:4.28 × 1012 VG/mL
                      注射體積:300nl
                      觀察時間:4周

                      2.8 全腦表達&跨血腦屏障(AAV-PHP.eB)

                      注射方式:尾靜脈注射
                      載體:pAAV-CMV-mScarlet-3FLAG& pAAV-CMV-mNeonGreen-3FLAG
                      血清型:AAV-PHP.eB
                      病毒滴度:1.10×1013 VG/mL&2.35×1013 VG/mL
                      注射體積:200nl(注射病毒總量:1.5×1013 VG)
                      觀察時間:3周

                      3、 皮層&AAV干擾(AAV-shRNA)
                      客戶發表文章:Nature Medicine. (IF=22.864). Cao X,et.al. (2013). Astrocyte-derived ATP modulates depressive-like behaviors.[腺相關病毒, 抑郁癥]


                      注射部位:小鼠mPFC
                      載體:AAV-CMV-P2rx2 shRNA-EGFP
                      病毒滴度:~3× 1012 VG/mL
                      注射體積:1.5ul
                      觀察時間:2周

                      4、 AAV稀疏標記
                      應用文獻:Luo WS, et al., (2016) Supernova: A Versatile Vector System for Single-Cell Labeling and Gene Function Studies in vivo. Sci Rep.
                      載體信息:pAAV-PTRE-tight-NLS-Cre(108-109VG/mL)、pAAV-EF1a-DIO(tTA-P2A-mScarlet)-WPRE(1012VG/mL)

                      5、在視網膜中的應用



                                  玻璃體腔注射         玻璃體腔:AAV-syn-GcaMP6s

                      6、在肝臟中的應用
                      客戶文章:FASEB Journal. (IF=5.391). Yang Y,et.al. (2018). Long-term exercise prevents hepatic steatosis: a novel role of FABP1 in regulation of autophagy-lysosomal machinery. [非酒精性脂肪肝,自噬溶酶體,腺相關病毒過表達]


                      注射方式:尾靜脈
                      載體:AAV8-TGB-Fabp1
                      血清型:rAAV2/8
                      注射體積: 200nl(病毒總量5×1011 VG)
                      觀察時間:1周

                      7、 在肺部中應用
                      AAV-LUNG感染肺部結果

                      7、 在胰腺中的應用
                      AAV-PAN感染結果

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