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                      DIA蛋白質定量與檢測

                      目    錄
                      • 產品介紹
                      • 常見問題
                      • 經典案例
                      • 結果展示

                      背景簡介 

                      數據非依賴性的掃描模式(Data-independent acquisition, DIA)是近幾年來發展的一種新的質譜數據采集方式??梢詫μ囟ㄙ|量范圍內的所有母離子進行碎裂,采集所有母離子的碎片離子信息進行蛋白定性和定量。目前流行的蛋白質組學研究手段,如iTRAQ\TMT、 Label-free、SILAC采用的都是數據依賴性的掃描模式(Data-dependent acquisition, DDA)。相對于DDA, DIA 具有更好的準確性和可重復性,是蛋白質組學研究的一大重要趨勢。下圖為 DIA 定量技術原理圖:


                       
                      技術優勢 
                      靈敏度高,無歧視地獲得所有肽段的信息,不會造成低豐度蛋白信息的丟失        循環時間固定,掃描點數均勻,定量準確度高        重復性好,重復樣品間的定量相關性可達到0.99以上。


                       技術路線 

                         
                      分析內容 

                      樣本類型 
                      蛋白質溶液,組織樣品、細胞及體液樣品(具體送樣量請咨詢各駐地項目經理)

                       
                      代表性文章
                      Collins B C , Hunter C L , Liu Y , et al. Multi-laboratory assessment of reproducibility, qualitative and quantitative performance of SWATH-mass spectrometry[J]. Nature Communications, 2017, 8(1):291.Rouwette T , Sondermann J , Avenali L , et al. Standardized profiling of the membrane-enriched proteome of mouse dorsal root ganglia provides novel insights into chronic pain[J]. Molecular & Cellular Proteomics, 2016, 15(6):mcp.M116.058966.

                      Q1:蛋白質定量DIA和傳統的非標記定量有何優勢
                      A:傳統的非標記定量一般需要通過分級的方法開展,耗時久、重復性差、數據結果可信度不高;蛋白定量DIA技術是新一代非標記定量技術,可通過更優的數據采集模式,在相同時間采集到更豐富的信息,壓縮周期的同時,大福度提高樣本間平行比較的重復性,數據結果可信度極高。
                       

                      蛋白質定量DIA用于慢性疼痛的研究 


                      Standardized Profiling of The Membrane-Enriched Proteome of Mouse Dorsal Root Ganglia (DRG) Provides Novel Insights Into Chronic Pain. Molecular & Cellular Proteomics. 2016.

                      研究背景 

                      慢性疼痛是一種治療方案有限的復雜疾病。雖對其發病機理進行了多次研究,但各結果間存在較大不一致性,主要受限于傳統蛋白質組shotgun技術固有的缺陷。發病機制依然不清晰。
                      研究結果 
                      大量數據表明CD13、CD24、CD44、CD90、CD133、EpCAM等表面標志物可以定義CSC,研究人員選擇CD24、CD133、EpCAM分選HuH1和HuH7不同細胞亞群,用于研究CSC生物學和分子水平異質性。免疫熒光染色表明,在兩種細胞培養形態下(單層培養、球體培養),兩個HCC細胞系均表現出明顯的細胞異質性。

                      實驗設計
                      炎癥性疼痛和神經性疼痛兩種模型鼠及其對應control鼠共4組,各3個生物學重復
                      每個生物學重復由10-13只鼠pooling而成
                      解剖獲得同側背根神經節膜部分提取蛋白進行DIA蛋白定量

                      圖 實驗設計類型

                      主要發現
                      1)DDA建庫鑒定到3067個蛋白,迄今鑒定數最多的背根神經節蛋白研究。
                      2)DIA四組都鑒定到的蛋白有2526個,其中CFA和Vehicle都鑒定到的有2581個;SNI和Sham都鑒定到的2600個,表明實驗重復性較好。
                      3)炎癥性和神經性疼痛差異蛋白分別為64和77,兩種模式共有差異蛋白為12個。
                      4)其中Serca蛋白在兩種模式小鼠中表達量變化相反,表明兩種疼痛的調控機制不同。
                      5)western blot和免疫組化對上述DIA結果進行了驗證


                       圖 四組實驗模型的蛋白聚類分析

                      參考文獻Rouwette T , Sondermann J , Avenali L , et al. Standardized profiling of the membrane-enriched proteome of mouse dorsal root ganglia provides novel insights into chronic pain[J]. Molecular & Cellular Proteomics, 2016, 15(6):mcp.M116.058966

                      結構域注釋柱狀圖Interproscan是蛋白質結構域和功能注釋最常用的軟件之一。為了能更全面的進行結構域的注釋,Interproscan整合了一些最常用的結構域數據庫,包括 Pfam、ProDom、 SMART 等結構域的數據庫,利用模式結構或特征進行功能未知蛋白的結構域注釋,繪制結構域注釋的柱狀圖。橫坐標代表蛋白數目,縱坐標代表注釋到的 IPR 條目。

                      蛋白表達水平聚類圖

                      蛋白表達水平聚類分析用于判斷不同實驗條件下蛋白表達量的相關性。每個樣品都會得到一個絕對或相對蛋白表達集合,將所有樣品表達集合并在一起,用于層次聚類分析和 K-means 聚類分析。

                      KEGG 富集通路圖在 KEGG 通路圖中,圈出了差異蛋白, 其中綠底色框內為鑒定出的總蛋白, 藍色框標記的是下調差異蛋白,紅色 框標記的是上調差異蛋白,黃色框標 記的是通路中該功能對應的多個蛋白中既有上調差異蛋白、也有下調差異 蛋白。

                      差異蛋白互作分析利用 StringDB 蛋白質互作數據庫進行 鑒定蛋白的互作分析,若在數 據庫中有相應的物種,則直接提取相應物種的序 列,若無,則提取近 源物種的序列,然 后將差異蛋白的序列與提取出的序列進 行 blast 比 對,得出相應的互作信息,構建網絡圖。

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