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                      磷酸化蛋白質組學

                      目    錄
                      • 產品介紹
                      • 常見問題
                      • 經典案例
                      • 結果展示

                      背景簡介 
                      蛋白質發生翻譯后修飾時其分子質量會發生相應的改變,通過質譜能夠精確測定蛋白質或多肽的分子質量。蛋白質磷酸化是一種非常重要且廣泛存在于原核生物和真核生物中的翻譯后修飾調控方式, 參與細胞的增殖、發育、分化、凋亡,細胞骨架調控、神經活動、肌肉收縮、新陳代謝及腫瘤發生等。由于磷酸化修飾的蛋白質在生物樣本中含量低、動態范圍廣,利用定量蛋白組學分析手段對富集得到的磷酸化肽段樣品進行定量分析前,需要對修飾進行富集從而提高修飾蛋白豐度。通過蛋白定量技術和修飾富集技術相結合,可對樣本中翻譯后修飾進行相對定量,篩選差異修飾位點和差異修飾蛋白。
                         
                      技術優勢 
                      全面性:以整個細胞所有蛋白為研究對象,囊括了細胞內所有具有生命功能的蛋白
                      可靠性:可一次性全面檢測不同蛋白激酶及磷酸化酶對同一個蛋白磷酸化程度的影響,
                      因而結果更加普遍性和可靠性
                      高效性:磷酸化蛋白質組學反映的是細胞內真實發生的事件,考慮了各種變量,
                      克服了經典生物學中逐步添加變量的缺陷,更為高效
                      探索性:磷酸化蛋白質組學以細胞內全部蛋白質為研究對象,相對于傳統的生物學研究
                      以及蛋白質芯片,更易發現未知的新磷酸化位點和磷酸化蛋白質
                       
                      技術路線 


                       
                      分析內容 
                       
                       
                      樣本類型 
                      蛋白樣品:1mg以上
                      組織樣品:植物組織樣本200mg以上,
                      血液樣品1ml以上(血漿注意用EDTA防凝),
                      尿液2ml,動物組織樣品至少1g,
                      細胞樣品為5X107個細胞,
                      酵母、微生物等干重200mg

                       

                      磷酸化蛋白質組揭示晝夜節律調控機制
                      Phosphorylation Is a Central Mechanism for Circadian Control of Metabolism and Physiology
                      研究對象:小鼠肝臟
                      期 刊:Cell Metabolism
                      影響因子:18.164
                      發表單位:馬克斯普朗克研究所 
                      發表時間:2017年1月
                      研究背景
                      生物鐘,作為生物體內一種無形的時鐘,控制著生物體內幾乎全部的代謝過程,并且其自身會不斷優化以保證生物體的穩態和代謝健康。生物鐘節律的紊亂會導致一系列的疾病,如糖尿 病、肥胖和代謝疾病。研究生物鐘,在醫學上有著重要的意義,并對生物學的基礎理論研究起著促進作用。許多研究已經利用轉錄組和蛋白質組技術研究了晝夜節律,但是磷酸化蛋白質 組尚未涉及。
                      研究策略
                      取樣策略:小鼠肝臟組織,兩天之中每3小時取樣一 次,每組4個生物學重復
                      質譜策略:磷酸化蛋白質組 TiO2富集,Label-free定量技術,Q Exactive HF質譜檢測,MaxQuant 搜庫
                      后續驗證:轉錄激活分析 ,Western Blotting 驗證
                      研究結果
                      1. 體內大規模晝夜磷酸化蛋白質組
                      小鼠肝臟組織中共鑒定到20,404個磷 酸化肽段,20,076個磷酸化位點, 4,461個磷酸化蛋白,且定量重復性 較高。
                       
                      2. 小鼠肝臟磷酸表達水平每天大幅度振蕩
                      其中27%的磷酸化肽段,41%的磷酸化蛋白表達水平 在2天內發生大幅度變化(圖1A)。表達水平聚類分 析,可以將磷酸化肽段分為光照和黑暗兩大類(圖 1B)。PCA分析表明,磷酸化蛋白質組循環周期為一 天(圖1C)。肝臟磷酸化蛋白質富集到不同代謝通 路,表明翻譯后修飾在晝夜節律調控中起著關鍵作用 (圖1 D)。
                      蛋白質表達量和磷酸化蛋白表達量均隨晝夜節律振 蕩,但是磷酸化蛋白質表達量振蕩幅度更大(圖 2A,圖2B)。蛋白質表達水平平均差異倍數為1.2, 磷酸化蛋白質表達水平平均差異倍數為5倍(圖 2C)。FC值累計曲線表明,80%的磷酸化累積強度 來自于20%的磷酸化水平振蕩的肽段,表明磷酸化水 平變化的蛋白為調控蛋白而非結構蛋白(圖2D)。
                       
                      3. CLOCK蛋白上氨基酸位點的磷酸化循環
                      小鼠肝臟中CRY1 S588和CRY2 S557分別在 CT0和CT21表達量達到峰值(圖3A)。在 CLOCK蛋白上發現了新的磷酸化位點S446和 S440/441,其磷酸化水平也出現周期性的變 化(圖3B),這些氨基酸殘基位于蛋白質序 列中富含絲氨酸的區域,在哺乳動物中高度保 守(圖3C)。CLOCK磷酸化突變體轉錄活性 低于野生型,然而CRY1介導的轉錄抑制不受 影響(圖3D,圖3E)。結果表明,CLOCK蛋 白上的S440 / S441和S446的體內磷酸化循環 在不含CRY1介導的抑制的情況下即可調節其 轉錄活性。
                       
                      4. 晝夜節律中小鼠肝臟激酶活性調控
                      激酶富集分析結果表明,ERK底物和AK- T/mTOR底物磷酸化水平在白天和晚上分 別達到峰值(圖4A)。與 EGFR-RAS-ERK-RSK級聯反應相關的激酶 磷酸化水平在白天達到峰值,這些酶多為 糖酵解,糖原合成和脂肪合成的限速酶, 使得小鼠在食物攝入最少的時候促進糖酵 解提供能量,抑制糖原和脂肪的合成。與 insulin-AKT-mTOR 級聯反應相關酶的磷 酸化水平在夜晚達到峰值,此時小鼠活動 活躍,營養充足,使得脂肪合成、生長相 關的代謝途徑比較旺盛(圖4 B)。


                       

                      功能注釋結果圖  圖中每個圈代表一個數據庫的注釋結果, 重疊部分代表多個數據庫共同注釋到的 蛋白, 非重疊部分代表相應數據庫單獨 注釋到的蛋白。


                      motif 分析圖每個樣品只顯示一個 motif 圖,極性 氨基酸(G, S, T, Y, C)顯示為綠色,中性氨基酸(Q,N) 顯示為紫色,堿 性氨基酸(K, R, H) 顯示為藍色,酸 性氨基酸(D,E)顯示為紅色,疏 水氨基酸 (A, V, L, I, P, W, F, M)顯示為黑色。  


                      差異蛋白聚類熱圖縱向是樣品的聚類,橫向是蛋白聚類, 聚類枝越短代表相似性越高。 從縱向 聚類可以看出樣品間蛋白含量的表達模式聚類。


                      富集有向無環圖(Cellular component)圖中的比較對順序和 GO 條目柱狀圖 中順序一致。每個方框或圓圈代表一 個 GO term, 放大方框中內容從上 到下代表的含義依次為:GO term 的ID、GO 的描述、GO 富集的 Adjuste dPv、 該GO下差異蛋白的數目/該GO 下背景蛋白的數目。


                       

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