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                      細菌基因組完成圖測序

                      目    錄
                      • 產品介紹
                      • 常見問題
                      • 經典案例
                      • 結果展示

                      背景簡介 
                      細菌全基因組具有相對較小、重復序列較高、易于突變等特點,通過全基因組測序,可以對細菌基因組進行測序、拼接、組裝,獲得完整細菌基因信息。細菌de novo測序已取代傳統方法成為研究細菌進化遺傳機制、關鍵功能基因的重要工具。目前,細菌全基因組測序利用三代測序結合二代測序的方法可以得到0 Gap的完整的基因組序列;對其進行功能基因注釋以及個性化分析,全面解析細菌生物學意義。
                         
                       技術優勢 
                      實驗安排靈活、服務周期短、速度快
                      測序結果準確性更高、成本更低
                      豐富的項目經驗與專業的生信分析團隊,提供最全面準確的信息分析
                       
                      技術路線 

                       
                      分析內容 
                       
                      樣本類型 
                      DNA送樣:
                      DNA濃度 ≥20ng/μl(Qubit),DNA質量≥15ug(Qubit)DNA電泳條帶單一,無明顯降解。
                      菌體送樣:
                      收集生長對數期菌體,收集離心菌體數3×1010個,于無菌離心管中,液氮速凍,干冰運輸
                       

                      Q1:為何完成圖選擇三代測序平臺?
                      A:受測序片段長度的限制,細菌基因組序列通常需要利用軟件算法將大量測序片段拼接起來,而細菌基因組中重復序列的存在,則會大大增加拼接的復雜度。細菌重復序列的大小從幾百bp到7 Kb不等,細菌框架圖的插入片段,只能解決少量的重復片段問題,因此組裝結果更加碎片化;細菌精細圖采用了6 Kb大片段文庫,可以跨過絕大部分重復序列,并將結果Scaffold控制在30條以內;而三代測序采用了10 Kb文庫,平均讀長也達到10 Kb以上,由于序列夠長,避免了細菌基因組中重復序列的影響,因此能夠獲得0 gap的完整組裝結果。
                      Q2:對于細菌基因組測序,三代和二代測序相比有何優勢?
                      A:三代測序相比二代測序而言,其優勢在于讀長長,GC含量影響小,而劣勢是測序成本偏高。對于細菌基因組測序來說,三代測序的長讀長可以解決細菌中的重復序列問題,也避免了異常GC菌株的測序不均勻問題。由于細菌基因組較小,需要的測序量不大,對于較為精細的細菌完成圖來說,三代成本甚至低于二代結合一代的策略。目前為止,在需要組裝完整性較低的細菌框架圖層面,二代測序仍能保持一定成本優勢。隨著三代測序通量提升和成本降低,未來三代測序有望在細菌基因組領域獲得更廣泛的應用。
                      Q3:細菌基因組中如何預測核糖體rDNA基因?
                      A:預測細菌基因組中的核糖體rDNA基因,通常有兩種方法:一是通過rDNA序列結構特征進行de novo 預測,二是利用近緣rDNA序列進行同源預測。其中前者預測更準確,但是需要組裝結果中具備完整的rDNA結構。在框架圖和部分精細圖組裝結果中,可能有rDNA區域組裝不完整,分布于多條scaffold中的情況,會導致de novo 測序方法rDNA預測不到的情況。如果想要獲得更完整的預測結果,可以預先提供近緣rDNA序列,使用同源預測方法,以改善預測效果。
                       

                      通過單分子實時測序解析可降解氰化物的產堿假單胞菌CECT5344基因組完成圖和甲基化情況


                      研究背景
                      產堿假單胞桿菌CECT5344在耐受氰化物的同時,還可以在堿性條件下利用氰化物和氰基衍生物作為氮源,極可能作為含氰液體廢液污染的生境的生物修復菌。之前已經有該菌株的基因組序列信息,現在采用單分子實時監測序列技術(SMAT)對其基因組進行重測序,得到由GC含量為62.34 %,長4696,984 bp的完整基因組序列。重測序得到的基因組補充了原來基因組中遺漏的部分片段信息,這些遺漏的片段多為轉座因子,此外還發現了預測在亞砜還原中起作用的5個基因。CECT5344的基因序列與門多薩假單胞菌高度同源,兩者約有70%的基因是相同的。與門多薩假單胞菌不同,CECT5344中并沒有發現推斷的致病性基因。CECT5344擁有氰水解酶和汞抗性蛋白的獨特基因,這些對被氰基和汞化合物污染的環境緩解尤為重要。通過SMAT測序還可以得到菌株的m6A類型的甲基化信息。菌株CECT5344的完整基因組序列為生物學遺傳特征的研究提供了基礎。
                      方法流程


                      研究結果
                      對CECT5344和門多薩假單胞菌基因組比對,對兩者的基因結構關系進行了研究,圖 4-1中用線連接的色塊表示兩個基因組的同源區域,最下方的色塊代表門多薩假單胞菌基因組中與CECT5344基因組反向的區段。
                      圖 4-2為完整的菌株基因組和甲基化堿基分布圖,基因組由4,696,984個堿基對和4436個預測的編碼序列組成。圓圈從內到外分別代表:GC偏斜、GC含量、50 kb窗口分析的全基因組甲基化、每個基因的鏈特異性甲基化、每百萬堿基對甲基化的量。
                      使用REBASE數據庫尋找到CECT5344基因組中編碼甲基轉移酶的基因,共鑒定預測了9個限制/修飾基因的基因座。圖 4-3中顏色代碼表示不同的限制/修飾類型,藍色的為甲基化酶,紅色為限制性酶。最內層為菌株的基因組完整圖和開放閱讀框的數目。
                                                       
                      參考文獻
                      Daniel Wibberga, Andreas Bremgesb, Tanja Dammann-Kalinowskia,et al.Finished genome sequence and methylome of the cyanide-degradingPseudomonas pseudoalcaligenes strain CECT5344 as resolved bysingle-molecule real-time-sequencing.Journal of Biotechnology, 2016, 232:61-68.
                       

                      原始數據堿基組成分布例圖橫坐標是reads 堿基坐標,縱坐標是所有reads 的A、C、 G、T、N 堿基分別占的百分比。每個位置上,A、C、G、 T在開始有所波動,后面會趨于穩定。一般情況下A 與T 相 等,C與G相等,各堿基所占百分比會因物種差異而不同。 基因組項目中,建庫比較均勻的情況下,代表不同堿基的 四種顏色的分界線應該波動極小。


                      原始數據堿基質量分布例圖橫坐標是reads 堿基坐標,縱坐標是reads 的堿基質量(SolexaScale: 40=Highest, - 15=Lowest),圖中垂直紅線”Ⅰ”指定的范圍是所有reads 堿基的綜合質量,紅色垂直方塊是質量的四分位值范圍,加黑粗線是質量值的中位數。     


                      單分子Clean 數據序列的長度分布統計圖橫坐標為測序reads 的長度,縱坐標為不同長度reads的數目,從上圖中可以看出,本次測序獲得的reads的長度大小主要集中分布在5000-15000bp,測序質量較高。

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