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                      宏轉錄組學

                      目    錄
                      • 產品介紹
                      • 常見問題
                      • 經典案例
                      • 結果展示

                      背景簡介

                      宏轉錄組學是在轉錄水平,以特定樣本中微生物群落的全部轉錄本為研究對象,分析微生物群落的基因表達與調控。宏轉錄組測序,避開了微生物的分離培養,為研究人員提供了從整體水平研究特定環境,特定時期微生物群落基因組轉錄情況以及轉錄調控規律的高效工具。

                      技術優勢

                      樣本處理個性化:由于微生物樣本組成復雜,將根據不同樣本特點,針對性進行樣本處理和文庫制備。
                      數據分析優化:精選數據拼接軟件,最大程度獲取微生物群落基因組轉錄信息。
                      注釋全面:采用最新版數據庫,更精確地注釋和分析微生物群落基因表達信息。
                      跨組學分析:從宏基因組到宏轉錄組,多個角度解析微生物群落結構與功能。

                      技術路線

                      分析內容

                      樣本類型

                      樣本類型:培養的細菌(≥ 5×106),組織,環境樣品,總RNA等
                      RNA總量:≥ 5 μg,濃度:≥50ng  
                      OD值:260/230≥1.5;260/280≥1.8
                      完整性(bioanalyzer2100):RIN值≥7,28S/18S≥0.7,或者峰型銳利,模擬電泳圖無彌散,5S峰顯示正常的樣品

                      Q1:對于小型動物,如果采樣時不能分離腸道和腸道內容物,宿主對宏轉錄組的影響很大,這種情況下,需要如何解決?

                      A:對于這種問題可以從以下兩個方面進行解決:
                      1.在實驗建庫過程中去除宿主污染(比如宏轉錄組中用去polyA法去除宿主mRNA);
                      2.另一種更直接的方法是,加大測序數據量,通過與宿主基因組比對去除宿主污染,但該方法前提是需要有宿主參考基因組,如果宿主沒有參考基因組,當污染很高的情況下,基本上沒有辦法去除宿主污染。

                      Q2:宏轉錄組測序完成后是否需要驗證?是用qPCR方法驗證嗎?
                      A:如果是群落水平的驗證,qPCR可以作為一個考慮的方法。但是宏轉錄組的微生物含量非常不穩定,qPCR不一定具有代表性。最好的辦法是找到基因的菌落歸屬,然后做一些單細菌克隆驗證。

                      Q3:如果不做宏基因組測序實驗,那是不是也沒有做宏轉錄組測序的必要?
                      A:宏轉錄組和宏基因組關注的點不一樣,宏轉錄組在建庫中可能會去掉一些RNA或者功能分析,但是實際上宏轉錄組相關的文章很多,因此不需要擔心這個問題。

                      宏基因組和宏轉錄組聯合分析綿羊瘤胃中微生物與甲烷產量的關系

                      反芻動物是單一且最大的人為溫室氣體甲烷來源的代表。甲烷由反芻動物消化道中的產甲烷古菌產生。雖然相同品種的單個動物之間甲烷產量的差異已被觀察到,這種變化的依據仍有待闡明。為探索這種甲烷產量的機理,研究人員測定了22只綿羊的甲烷產量,結果揭示甲烷產量具有可重復、可量化的特征。宏基因組和宏轉錄組測序證實,甲烷排放量高和低的綿羊都具有類似的產甲烷菌豐度和甲烷生成途徑基因。然而,對于甲烷排放量高的綿羊,產甲烷途徑基因的轉錄大幅增加。鑒定出一組瘤胃產甲烷菌,這些產甲烷菌的甲烷生成途徑轉錄譜與甲烷產量相關。上圖為瘤胃產甲烷菌進化分析。

                      參考文獻
                      W Shi,et al. (2014)Methane yield phenotypes linked to differential gene expression in the sheep rumen microbiome. Genome Research. doi/10.1101/gr.168245.113
                       

                      樣本物種豐度柱狀圖
                      根據物種注釋結果及豐度統計,默認選取各分類水平(界門綱目科屬種)豐 度最高的20個物種,進行樣品豐度柱狀圖的繪制,該柱狀圖以堆疊柱狀圖 (stacked bar chart)形式展現, 便于更直觀地進行樣品間物種豐度的比較。 在各個層級中,可以直觀的看到優勢菌種的表達情況及在各個不同處理 中的變化趨勢。


                      KEGG注釋統計根據KEGG注釋總表,可以對KEGG注釋的總體情況進行Unigene數目的統計。

                      抗生素耐藥基因注釋CARD全稱是Comprehensive Antibiotic Resistance Database,目前該數據庫 仍在不斷地更新,該數據庫以ARO(Antibiotic Resistance Ontology)為核心對耐藥性數據進行整理,以達到數據實時更新的效果。通過對Unigene進行對 應的抗生素耐藥性注釋,并統計抗生素耐藥功能的豐度。

                      eggNOG功能注釋eggNOG是一個用于同源聚類基因群注釋的專業數據庫,它包括來自原始COG/KOG的功能分類,以基于分類學的功能注釋。

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