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                      全轉錄組測序

                      目    錄
                      • 產品介紹
                      • 常見問題
                      • 經典案例
                      • 結果展示

                      背景簡介
                      狹義的轉錄組默認只包含mRNA,但是廣義的轉錄組指的是細胞或組織中所有轉錄產物的集合,其中包含mRNA和非編碼RNA(non-coding RNA, ncRNA)。非編碼RNA目前的研究多集中在具有調控功能的small RNA(以miRNA為代表),長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)和環狀RNA(circular RNA, circRNA)上,而這幾類ncRNA的調控對象都和mRNA有關。因此,全轉錄組即包含了ncRNAs和mRNA。全轉錄組測序即對以上四種ncRNA進行測序,并分析這四者之間復雜的相互作用關系。

                      技術優勢
                      文庫優化:針對不同長度序列采用兩種文庫構建方法,去核糖體鏈特異性文庫可獲得mRNA、lncRNA和circRNA信息。
                      數據全面:全轉錄組測序可獲取4類主要RNA(miRNA,mRNA,lncRNA,circRNA)數據,可對這些數據進行標準分析及整合分析
                      關聯全面:通過對mRNA /miRNA/lncRNA/circRN序列測定及后續分析,深入開展全轉錄組調控網絡(ceRNA網絡)分析

                      技術路線

                      分析內容

                      樣本類型

                      細胞,組織,體液、血清、血漿、全血,總RNA等
                      建議總RNA起始量:>15 μg,濃度≥200 ng/μL

                      近期用戶文章
                      1. Sun JC, et al. (2016) A computationally constructed ceRNA interaction network based on a comparison of the SHEE and SHEEC cell lines. Cell Mol Biol Lett 21 (1) :21.
                      2. Wang Wei, et al. (2017) Identification of miRNA, lncRNA and mRNA-associated ceRNA networks and potential biomarker for MELAS with mitochondrial DNA A3243G mutation. Scientific Reports 7 :41639.

                      Q1:全轉錄組測序為什么需要構建兩個文庫?
                      A:全轉錄組測序需要構建2個測序文庫,一個小RNA文庫和一個去除核糖體RNA的鏈特異性文庫,然后分別上機測序。小RNA長度較短,一般小于50nt,采用測序策略為50SE。其他三類RNA序列一般大于200,通常在1000以上,最高可達幾萬,通過片段化構建150PE測序文庫。最后小RNA文庫可以獲得miRNA序列信息,去核糖體的鏈特異性文庫可以獲得mRNA、lncRNA和circRNA的序列信息。

                      Q2:什么是ceRNA調控網絡(ceRNA networks)?
                      A:一些非編碼RNA,如lncRNA和circRNA等會競爭結合miRNA,導致miRNA調控的靶基因發生變化。這類新型的非編碼RNA除了轉錄前調控等功能外,一個重要的功能就是像海綿一樣對miRNA有吸附作用。這種具有miRNA吸附作用的RNA,我們稱作內源性競爭結合RNA(Competitive endogenous RNA, ceRNA),具體的相互作用關系如下圖:

                      circular RNA(HRCR)靶標結合miR-223保護心臟免受心肌肥厚和心臟衰竭

                      本研究中作者首先通過miRNA基因芯片分析、Northern blot、RT-PCR等技術手段發現,ISO處理14天后,miRNA-223的表達量顯著上調,并且在患有心臟肥厚和心臟衰竭的人和小鼠心臟中miRNA-223的表達量也有明顯的上調,初步得出結論:miRNA-223參與調控心肌肥厚和心臟衰竭。接下來作者利用miR-223過表達轉基因小鼠以及miR-223基因敲除轉基因小鼠進一步驗證表型,結果發現miR-223過表達小鼠成年后出現明顯的心肌肥厚和心臟衰竭癥狀,而miR-223基因敲除小鼠表型相反,進一步證明在活體內,miR-223可以誘導心肌肥厚和心臟衰竭。

                      接下來作者進一步研究miR-223對心肌細胞的影響,結果發現miR-223過表達細胞中出現明顯的心肌肥大反應,而miR-223敲除細胞中,ISO處理引起的心肌肥大反應明顯被破壞,說明miR-223過表達會促進心肌肥厚,而miR-223基因敲除會阻斷心肌肥厚。


                      為了進一步研究miR-223調控心肌肥厚和心臟衰竭的分子機制,作者篩選了一些參與調控心肌肥厚的基因作為miR-223的靶標候選基因,然后通過western blot分析miR-223過表達和缺失突變體中上調以及下調的基因,結果發現miR-223可以顯著抑制ARC的表達,而前人已經有研究報道ARC參與調控心肌肥厚和細胞凋亡,所以初步推斷ARC可能是miR-223下游的靶標位點。
                      接下來作者通過RNAhybrid分析發現,ARC的3′UTR含有潛在的miR-223的結合位點,然后通過Target Protector technology進一步證明miR-223可以特異調控ARC的表達,ARC 3′UTR的翻譯活性受到miR-223的抑制。
                      接下來作者構建了一個不帶ARC 3′UTR的腺病毒載體,這種病毒載體對miR-223不敏感,結果發現這種腺病毒可以減弱ISO處理誘導的心肌肥厚反應。然后作者通過ARC過表達轉基因株系進一步證明了ARC可以保護心臟免受心肌肥厚和心臟衰竭,減少細胞凋亡。以上這些研究結論表明:在調控心肌肥厚和心臟衰竭的過程中,ARC是miR-223的下游靶標位點。


                      CircRNA和miRNA的互作是目前研究的一個熱點話題,為了進一步研究是否有CircRNA參與調控miR-223的表達,作者從CircRNA數據庫中隨機篩選出100個CircRNA,通過qRT-PCR驗證篩選到36個CircRNA,然后通過Northern blot篩選到一個特異性表達的CircRNA: mm9-circ-012559(HRCR)。
                      然后作者通過RNAhybrid分析發現HRCR包含6個CircRNA的靶標結合位點,初步表明HRCR可以和miR-223結合。接下來作者通過生物素標記,qRT-PCR,Northern bolt,pull down assay、熒光原位雜交(FISH)等技術手段,從正向以及反向兩個角度分別驗證HRCR和miR-223之間的互作關系,結果發現miR-223和HRCR在細胞質中存在共定位現象,HRCR可以直接結合到miR-223上。

                      HRCR和miR-223存在互作,而miR-223可以通過調控下游ARC的表達,進而調控心肌肥厚和心臟衰竭,為了進一步研究HRCR對ARC表達的影響,作者構建了HRCR過表達載體和基因敲除突變體,結果發現HRCR過表達載體中,ARC的表達量和活性顯著增加,HRCR敲除突變體中,ARC的表達量和活性顯著降低,并且HRCR可以消除miR-223對ARC表達的抑制作用,說明HRCR可以通過調控miR-223以及ARC的表達,進而調控心肌肥厚。

                      參考文獻
                      Wang K, Long B, Liu F, et al. A circular RNA protects the heart from pathological hypertrophy and heart failure by targeting miR-223.[J]. European Heart Journal, 2016, 37(33):2602-2611.

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