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                      三代全長轉錄組測序

                      目    錄
                      • 產品介紹
                      • 常見問題
                      • 經典案例
                      • 結果展示

                      背景簡介

                      全長轉錄本測序基于單分子實時測序Pacbio Sequel平臺,超長讀長可獲得mRNA全長序列及完整結構信息??朔o參考基因組物種轉錄本拼接短、信息不完整的難題,實現有參考基因組物種研究可變剪切及融合基因等結構變異。

                      技術優勢

                      平臺優,質量好,性價比高。
                      基于小而強大的Pacbio Sequel平臺,獲取mRNA全長序列,
                      文庫構建時無需將轉錄本打斷,信息分析無需組裝,精準重構轉錄組全貌。
                      科學方案設計:從材料選取,建庫測序,到數據分析,每一步都需要科學、縝密的設計,以保障高質量研究成果.

                      技術路線

                      分析內容

                      樣本類型

                      由于是測全長,所以比二代轉錄組測序實驗對RNA質量的要求更高。
                      樣品量:總RNA>5 ug/文庫;總量>15 ug(3個文庫);
                      樣品純度:OD260/280≥1.8,OD260/230≥1.0,260nm處有正常峰值;
                      RNA 完整性:總RNA的RIN值≥8.0,28S/18S≥1.3;圖譜基線無上抬;5S峰正常

                      Q1:全長轉錄組測序中,為什么要建3個以上文庫?
                      A:全長轉錄組采用單分子實時測序技術,通過構建啞鈴型文庫,以環形方式循環測序。測序時,短片段文庫更容易落入零模波導孔。為了避免測序過程中短片段文庫偏好性,保證不同長度轉錄本的覆蓋度,因此,會構建3個或3個以上文庫。

                      Q2:全長轉錄組是否需要打斷,拼接?
                      A:全長轉錄本是包括從5`末端到3`-poly A tail的,包括mRNA全長序列以及完整結構信息的完整轉錄本,片段集中分布于1-6kb,sequel平均讀長在12kb左右,最長的文庫都可以測至少一遍,所以建庫前不需要打斷,后期分析也無需拼接,得到的就是完整的mRNA。

                      利用單分子實時測序研究高粱轉錄組

                      研究背景
                      高粱是世界上非常重要的C4作物,也是重要的耐脅迫的谷類,重要的研究非生物脅迫的模式生物。本研究以高粱為研究材料,采用Pacbio的Iso-Seq策略,調研高粱轉錄組特征,改進高粱基因集注釋。

                      研究結果
                      1. AS事件分析
                      本研究發現,有10,053個isoform經歷了AS事件,其中只有2,950個isoform和現有的基因模型吻合。Pacbio數據結果證實高粱轉錄組AS事件比之前的認知更為普遍。同時,文章對在Pacbio中的多isoform的基因做了RT-PCR驗證,證實了結果的可靠性。
                      2. APA事件分析
                      APA事件是在編碼區或3’-UTR區形成isoform,提高轉錄本的復雜性。由于單分子測序技術利用Oligo dT引物合成cDNA,poly(A)會出現在測序結果中。因此,單分子測序技術是研究APA的有力工具。本文發現在已表達的14,550個基因中,11,013個至少有1個poly(A)位點。
                      3. 新基因發現
                      原來的參考基因集有~34,500個基因。在該研究中預測到2171個可能的新基因。為了鑒定這些新基因是否在其他物種中存在,我們使用BLAST中的tblastx和blastx分別比對到收集的植物cDNA序列和Swiss-Prot蛋白數據庫,共檢測到971個基因。為了證明這些新基因的表達,隨機選擇7個基因并用RT-PCR驗證,證實了新基因的表達和剪切。
                       
                      圖 Iso-seq和已注釋的不同可變剪切類型的比較
                      參考文獻
                      Abdelghany S E, Hamilton M, Jacobi J L, et al. A survey of the sorghum transcriptome using single-molecule long reads[J]. Nature Communications, 2016, 7:11706.

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