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                      絕對定量轉錄組測序

                      目    錄
                      • 產品介紹
                      • 常見問題
                      • 經典案例
                      • 結果展示

                      背景簡介 

                      常規轉錄組測序由于文庫PCR擴增偏好性,所有序列并不會被同比例放大,因而造成測序定量結果與樣本中轉錄本的原始豐度不一致,導致差異基因篩選不準確(圖1)。這也是造成qPCR驗證測序結果不一致的主要原因。聯川生物推出的絕對定量轉錄組測序,采用主流UMI標記技術[1,2,3],通過UMI標記每一條序列,可以消除PCR擴增偏好對定量的干擾,真實反映樣本中轉錄本的表達豐度(圖2)。在文庫PCR擴增和測序過程中難免會引入錯誤的堿基,具有相同UMI標記的序列可以基于多序列比對來糾正PCR擴增和測序過程中引入的錯誤,確保獲得轉錄本的真實序列(見圖3)。 

                      圖1 PCR擴增產生的duplication顯著干擾準確定量

                      圖2 UMI標記技術消除duplication干擾

                      圖3 UMI標記技術糾正序列錯誤
                       

                      技術優勢 

                      真實定量:采用UMI標記技術,每一條序列都被唯一標識,保留序列真重復,去除PCR擴增假重復,真實反映樣本中轉錄本的表達豐度。真實序列:具有相同UMI標記的序列可以基于多序列比對來糾正PCR擴增和測序過程中引入的錯誤, 確保獲得轉錄本的真實序列。

                      技術路線 

                      分析內容 


                       
                      樣本類型 

                      細胞,組織,全血,血清,血漿,總RNA等
                      建議總RNA起始量:2 μg,最低1 μg,濃度≥50 ng/μL


                      參考文獻
                       1.Shiroguchi K, et al. Digital RNA sequencing minimizes sequence-dependent bias and amplification noise with optimized single-molecule barcodes. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012 Jan 24;109(4):1347-52.2.Kivioja T, et al. Counting absolute numbers of molecules using unique molecular identifiers. Nat Methods. 2011, 9(1):72-43.Saiful Islam, et al. Quantitative single-cell RNA-seq with unique molecular identifiers. Nature Methods 2014, 11:163-166.

                      Q1:轉錄組測序結果上調,而qPCR結果下調,問題出在哪兒?

                      A1:主要有這6個原因:1)文庫PCR擴增偏好,2)你驗證的分子不對,3)用不同批次的樣品做驗證,4)用不同的樣本類型做驗證,5)拿低表達或差異不顯著的基因做驗證,6)樣本比對關系搞反。查看詳情

                      Q2:使用絕對定量轉錄組測序對我有什么幫助?

                      A2:使用絕對定量轉錄組測序,助您篩選出真實的差異表達基因,讓你的時間不再花在假陽性結果的驗證上,更快地開展下游功能驗證實驗,快人一步地發表研究成果。
                       

                      使用單分子標簽的RNA-Seq會最小化序列偏好和擴增噪音


                      研究內容

                      這項工作討論了如何最小化PCR擴增偏好性(就是Duplication)對測序數據,特別是低拷貝序列,定量分析的干擾。研究團隊開發出了一種稱為Digital RNA sequencing的方法:序列在反轉錄后,加入大量的標簽(barcode),幾乎每個cDNA都被唯一的barcode標記,然后進行PCR擴增獲得轉錄組測序文庫(見下圖)。由于序列是被barcode唯一標記的,計算序列拷貝數時,不再直接統計同一種reads的數量,而是統計每種reads有多少個unique的barcode。而具有相同barcode的同一種reads,無論有多少拷貝數,都只計作一個拷貝,即來自PCR擴增的假重復(Duplication)被有效去除。
                      可以簡單地認為,在樣本中cDNA1有3個拷貝,cDNA2有2個拷貝,比例為3:2,然后用大量不同的barcode標記這5條序列,每條序列都被unique的barcode標記,最后進行PCR擴增完成文庫制備。由于Duplication的存在,在沒有barcode標記的情況下,cDNA1經擴增變成了9個拷貝,cDNA2變成了12個拷貝,比例變成了3:4,而兩者原始的比例是3:2;而標記了barcode的cDNA1和cDNA2,合并具有相同barcode的同種序列后,cDNA1和cDNA2仍保持原始的拷貝數和比例,此種方案下測序定量結果準確反映了樣本中序列的真實豐度和比例。


                       

                      圖  標簽標記序列法去除Duplication的原理

                      參考文獻

                      Shiroguchi K, et al. Digital RNA sequencing minimizes sequence-dependent bias and amplification noise with optimized single-molecule barcodes. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012 Jan 24;109(4):1347-52.
                       

                      差異基因聚類分析熱圖
                      用于判斷基因在不同實驗條件下調控模式的聚類模式根據樣品基因表達譜的相近程度,將基因進行聚類分析,直觀地展示基因在不同樣品(或是不同處理)中的表達情況,由此獲取生物學相關信息。

                      差異顯著差異表達基因上下調頻數統計柱狀圖用于統計差異基因數目

                      差異表達基因分析火山圖
                      用于了解差異表達基因的整體分布情況。以log2(foldchange)為橫坐標,-log10(pvalue)為縱坐標,對差異表達分析中所有的基因繪制火山圖。其中橫坐標代表基因在不同樣本中差異表達倍數變化;縱坐標代表基因表達量變化差異的統計學顯著性。

                      差異基因GO富集柱狀圖
                      用于反映在生物過程(biological process)、細胞組分(cellular component)和分子功能(molecular function)富集的GO term上差異基因的個數分布情況。

                      GO功能富集散點圖
                      用于展示GO term的富集情況。Rich factor表示位于該GO的差異基因個數/位于該GO的總基因數,Rich factor越大,GO富集程度越高。

                      皮爾森相關系數圖
                      用于反映生物學重復、樣本相關性,確保后續的差異基因分析得到更可靠的結果。

                      可變剪切統計圖
                      對該物種及其相應的測序樣品進行可變剪切事件的分類及統計。

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