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                      外顯子組測序

                      目    錄
                      • 產品介紹
                      • 常見問題
                      • 經典案例
                      • 結果展示

                      背景簡介

                      外顯子組(Exome)是一個物種基因組中全部外顯子(Exon)區域的總和,該區域包含著合成蛋白質所需要的信息,涵蓋了與個體表型相關的大部分的功能性變異。外顯子組測序&目標區域測序是指利用特制的探針對感興趣的蛋白編碼區域DNA或某段特定序列進行富集,隨后通過高通量測序技術對該目標區域進行深度測序,發現特定遺傳信息,極大提高了基因組中外顯子&目標區域的研究效率,顯著降低了研究成本。該技術可用于鑒定和研究孟德爾疾病,復雜疾病如癌癥、糖尿病、肥胖癥等的致病基因和易感基因,進行群體研究,如人類罕見遺傳變異,腫瘤突變基因研究等,幫助研究人員更好地解釋這些疑難雜癥的致病機理。
                       

                      技術優勢

                      高捕獲效率:采用捕獲效率更優異的Agilent Human SureSelect V6 kit(58M)進行外顯子組捕獲。
                      可靠的基因突變鑒定方案:采用不同的針對性方案進行遺傳病與腫瘤突變基因的可靠鑒定。
                      權威的突變鑒定軟件:采用權威的GATK,muTect,VarScan2等軟件更準確鑒定突變。

                      技術路線

                      分析內容

                      樣本類型

                      人的細胞,組織,全血,總DNA等
                      建議總DNA起始量:5 μg,最低1 μg,濃度≥50 ng/μL(Qubit定量)

                       

                      Q1:什么是copy number variation (CNV)基因組拷貝數變異?

                      A:基因組拷貝數變異是基因組變異的一種形式,通常使基因組中大片段的DNA形成非正常的拷貝數量。例如人類正常染色體拷貝數是2,有些染色體區域拷貝數變成1或3,這樣,該區域發生拷貝數缺失或增加,位于該區域內的基因表達量也會受到影響。如果把一條染色體分成A-B-C-D四個區域,則A-B-C-C-D/A-C-B-C-D/A-C-C-B-C-D/A-B-D分別發生了C區域的擴增及缺失,擴增的位置可以是連續擴增如A-B-C-C-D也可以是在其他位置的擴增,如A-C-B-C-D。

                      Q2:癌組織為什么要采用高深度測序?

                      A:相對于遺傳病而言,腫瘤組織樣品中突變位點的等位基因頻率較低,一方面由于腫瘤細胞在腫瘤組織中的占比偏低,另一方面則由于癌癥發展后期產生的突變僅存在于極少量的腫瘤細胞中,采用高深度測序可以盡可能全面的檢測到與癌癥發生發展相關的變異。通常推薦的外顯子測序深度為,癌組織大于150x,癌旁組織/血液大于50x。

                      Q3:人外顯子測序一般推薦多少測序深度?

                      A:建議有效測序深度在100x以上。有文獻顯示外顯子組測序深度會影響變異檢出率,隨著測序深度的升高,變異檢出率增大,且達到一定深度時,變異檢出達到平穩狀態。

                      外顯子組測序發現LDLR和APOA5罕見變異增加心肌梗塞風險


                      研究背景

                      心肌梗塞(Myocardial infarction,MI)是一種在全世界范圍內致人死亡的常見原因,表現為一種復雜的遺傳模式。當MI發生于人生早期(男性≤50歲發病,女性≤60歲發?。?,遺傳因素是主要的風險因素。之前的研究發現,LDL(low-density lipoprotein)基因上的罕見變異增加單個家庭中的成員發生MI風險,而其常見變異與人群中的MI風險相關。該研究關注LDL基因上的罕見變異是否會增加人群在早期發生MI的風險。


                      研究結果

                      研究人員通過結合外顯子組測序、基因芯片、靶向測序在大量疾病和對照樣本的篩選與MI相關的罕見變異(需要至少10000樣本量才能達到80%的統計功效)。研究人員再對篩選到的罕見變異(MAF<1%)進行分組,包括Nonsynonymous、Deleterious(PolyPhen)、Deleterious(broad)、Deleterious(strict)和Disruptive組,采用Burden檢驗法對這些罕見變異集合進行關聯性分析找出與MI顯著相關的罕見變異,最后通過計算OR值判斷這些罕見變異導致MI的風險。經過分析發現MI患者的2個基因含有罕見變異的頻率顯著高于正常人。攜帶LDLR(low-density lipoprotein receptor)罕見非同義突變患MI風險比正常人高4.2倍,攜帶LDLR 無義突變患MI的風險高13倍。大約2%的早期MI患者LDLR基因含有罕見致病突變。攜帶APOA5基因罕見非同義突變患MI的風險增加2.2倍。與非攜帶者相比,LDLR突變攜帶者的血漿LDL膽固醇較高,APOA5突變攜帶者的血漿甘油三酯較高??偨Y其它研究結果來看,脂蛋白甘油三酯以及LDL膽固醇代謝紊亂會增加MI患病風險。

                      圖1 (a)通過對9793例樣本進行測序發現位于LDLR的罕見變異(包括MAF<1%的包括無義變異、可變剪切變異、移碼變異)。(b) 在不同罕見變異分組中患者的LDL膽固醇水平。


                      參考文獻

                      Do, R., et al., Exome sequencing identifies rare LDLR and APOA5 alleles conferring risk for myocardial infarction. Nature, 2015. 518(7537): p. 102-6.

                      與基因組比對(覆蓋度、測序深度)樣品比對率是指比對到參考基因組上的數據量占有效測序數據量的比值,反映樣本與參考基因組的相似性。測序深度是指比對到參考基因組的堿基總數占基因組的比值;覆蓋度是指被測到的該物種基因組堿基總數占該物種基因組長度的百分比。

                      SNP分析SNP全稱Single Nucleotide Polymorphisms,是指在基因組上單個核苷酸的變異,形成的遺傳標記,其數量很多,多態性豐富?;蚪M上單 個核苷酸的變異包括置換,缺失和插入。采用FreeBayes對各樣品比對 結果進行個體SNP的檢測。

                      InDel分析InDel (Insertion-Deletion) 是指相對于參考基因組,樣本中發生的小片段的插入缺失,該插入缺失可能含一個或多個堿基。根據InDel在基因組中的位置,可以分為編碼區序列的InDel和非編碼區序列的InDel。編碼序列中的InDel發生與編碼蛋白質的功能和氨基酸位點在結構和功能上的重要性有關。采用FreeBayes對各樣品比對結果進行個體InDel的檢測。

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