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                      基因組重測序

                      目    錄
                      • 產品介紹
                      • 常見問題
                      • 經典案例
                      • 結果展示

                      背景簡介

                      基因組重測序是對已知基因組序列的物種進行全基因組范圍的測序,并在此基礎上對個體或群體進行差異性(SNP、InDel和SV等)分析?;诨蚪M重測序技術,可以快速進行資源普查篩選,尋找到大量遺傳變異,實現遺傳進化分析及重要性狀候選基因的預測。隨著測序成本降低以及擁有參考基因組序列物種增多,基因組重測序成為研究遺傳育種和群體進化的有效方法。

                       

                      技術優勢

                      在全基因組水平檢測與表型關聯的高頻、低頻、甚至是罕見的點突變及結構變異信息
                      對于個體樣本,可獲得全面的基因組突變譜信息
                      對于群體樣本,可進一步研究物種的進化歷史、環境適應性、自然選擇和性狀定位

                       
                      技術路線

                       

                      分析內容

                      樣本類型

                      細胞,組織,全血,總DNA等
                      建議總DNA起始量:5 μg,最低0.5 μg,濃度≥300 ng/μL(Qubit定量)

                      Q1:基因組重測序可以檢測哪些變異?

                      A:重測序一般可以檢測單核苷酸多態性(SNP)、插入缺失(InDel)、拷貝數變異(CNV)、染色體結構變異(SV)等。

                      Q2:全基因組測序的測序深度如何選擇?

                      A:測序深度根據研究目的、樣本量及合作伙伴的預期而定。30×測序深度即可檢測絕大部分SNV,但如果客戶的研究目的是尋找癌組織中較大的結構變異、少數腫瘤細胞攜帶的豐度較低的突變,建議測序深度(一般)至少50×以上;群體重測序可以使用較低深度測序(~10×),用群體分析策略尋找相關變異。

                      Q3:FFPE樣本為什么不推薦使用全基因測序?

                      A:FFPE樣本提取的DNA多數存在降解的情況,基因組呈現片段化,CNV/SV等結構性變異檢出的假陽性率較高,無法體現全基因組測序在結構變異檢測方面的優勢,且通過增加測序深度提高變異檢出準確性的成本太高。

                      Q4:全基因組測序相對于全外顯子組測序的優勢是什么?

                      A:全外顯子組測序捕獲基因組的外顯子區域,其基因組信息約占基因組大小的1.5%;全基因組測序對于全基因組層面來說,變異信息更全面,沒有止步于編碼區,而是向整個非編碼區擴展,性價比更高,平均數據單價較全外顯子組測序便宜了5倍以上。近些年非編碼區突變的研究越來越多,其可與多種癌癥在內的復雜疾病發生相關。

                      全基因組測序鑒定卵巢癌化療抗性特征 


                      研究背景
                              過去的30年間,高級別漿液性卵巢癌(High-grade serous ovarian cancer, HGSC)患者的存活情況幾乎沒有改善,標準治療的方法未見比以鉑類為主要成分的聯合化療方法效果有提高。本文研究化療選擇下HGSC基因組進化,以期發現如何克服化療抗性產生的治療方法。


                      方法流程
                      取材:92個HGSC患者原發實體瘤、腹水樣本或尸檢樣本共114個樣本及正常對照
                      測序: 1. HiSeq 2000,PE 100 bp ; 2. WGS:Tumor 52×、Normal 40× ; 3. 轉錄、甲基化、miRNA支撐WGS數據
                      分析: 1. 與參考基因組GRCh37進行比對 2. 檢測somatic mutation 3. 高頻突變基因篩選 4. 突變特征分析 5. 融合基因檢測 6. 分子分型

                      Driver mutation研究

                      80個實體瘤和12個腹水樣本共找到36,561個SVs,其中每個樣本SV數目在48~1,064個,所有樣本TP53突變普遍存在。另有超過一半的原發瘤樣本,同源重組修復功能受損或者BRCA甲基化。多個樣本抑癌基因RB1、NF1、RAD51B、PTEN 和化療抗性基因CCNE1 發生突變,且CCNE1 基因突變與同源重組通路不同。

                      突變特征分析

                      發現樣本以BRCA signatrue和Age signatrue為主。如果樣本只是產生BRCA 基因突變,那么進行化療是敏感的,但一旦樣本出現CCNE1 基因突變,那么個體進行化療比較難治療或者會產生抗性。并且結合臨床研究,出現CCNE1 突變的患者預后比較差。

                      化療差個體分析

                      患者化療后其編碼區和非編碼區SNV/InDel數量增多,且化療后產生治療抗性的患者存在BRCA1啟動子去甲基化、BRCA1 / BRCA2 功能恢復性突變、SLC25A40-ABCB1基因融合的情況。


                      研究結論
                      通過對HGSC患者的成對樣本進行WGS研究,重點關注前期化療有效且后期化療產生抗性的患病個體。在產生化療抗性的個體中頻繁檢測到CCNE1基因突變,說明CCNE1基因突變意味著預后差。通過檢測不同治療階段癌細胞的變異情況,發現基因斷裂導致抑癌基因失活是產生化療抗性的重要原因。此外還觀測到一些分子事件與獲得性抗性相關,如BRCA1或BRCA2 reversion,BRCA1啟動子去甲基化,周期性啟動子融合。此項研究揭示了在化療選擇壓力下HGSC患者基因組的異質性和適應性,在選擇化療方案作為HGSC治療手段時,需要采用必要的策略避免產生化療抗性。

                      參考文獻
                      Patch A M, Christie E L, Etemadmoghadam D, et al. Whole–genome characterization of chemoresistant ovarian cancer[J]. Nature, 2015, 521(7553):489-94.

                      測序深度圖利用重復標記后的比對結果進行覆蓋度,深度等的統計。左圖為不同 的測序深度的堿基比例。橫坐標表示測序深度,縱坐標表示測序深度為x的堿基在所有堿基中的比例;右圖為不同測序深度上的累積堿基比例,橫 坐標表示測序深度,縱坐標表示測序深度超過x的堿基在所有堿基中的比例。 比如測序深度為50X對應的堿基比例約為95%,表示約有95%的堿基其測 序深度大于50X。


                       
                       染色體覆蓋深度圖橫坐標表示各染色體,縱坐標表示平均覆蓋深度。

                       

                       


                      Reads覆蓋度階梯圖縱坐標為測序深度對應的Reads的覆蓋比例,不同顏色代表不同的測序深度,圖中 樣本A 93.23%的Reads覆蓋了20X以上,樣本B 94.66%的Reads覆蓋了20X以上。
                       
                       

                       

                       
                       
                      基因組和外顯子區域SNP特征圖第1個柱狀圖中,Hom代表純合,其縱坐標代表基因型為純合的SNP數目;Het代表雜合,其縱坐標代表基因型為雜合的SNP數目, Het rate代表雜合基因型的SNP在所有SNP中的比例。第2個柱狀圖中,tv代表顛換,其縱坐標代表tv的SNP數目;ts代表轉換,其縱坐標代表ts的SNP數目。ts/tv是轉換/顛換的比值。

                       


                      SV circos圖選取測序質量值top20個SV進行了圈圖繪制,圈圖中間弧形連接的片段發生了染色體結構變異,位置發生了重排。

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